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DMP法測(cè)定漆酶酶活

 DMP法測(cè)定漆酶酶活

A.1 原理

漆酶能氧化DMP為3,5,3’,5’-四甲氧基二苯基醌,該產(chǎn)物在470nm處有最大吸收峰,其消光系數(shù)為49.6 mmol-1Lcm-1,在一定濃度范圍內(nèi)該產(chǎn)物濃度與其吸光度值成線性關(guān)系,通過(guò)測(cè)定吸光度的變化值來(lái)計(jì)算產(chǎn)物的生成速率,酶活的定義為在一定條件下,每分鐘氧化1 umol DMP或生成1umol 3,5,3’,5’-四甲氧基二苯基醌所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

A.2.1 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3.5)

稱取檸檬酸14.71g,用水準(zhǔn)確稀釋至700ml,稱取磷酸氫二鈉14.33g,用水溶解并準(zhǔn)確稀釋至200 mL。將檸檬酸溶液加入到磷酸氫二鈉溶液中,邊加邊攪拌并調(diào)pH至3.5。

A.2 .2 DMP

    稱取DMP0.154g,用水溶解并定容至100mL。

A.3 儀器和設(shè)備

可見(jiàn)分光光度計(jì)

分析天平:精度為±0.0001g。

pH計(jì):精度為±0.01 pH單位。

恒溫水?。壕?plusmn;0.2℃

A.4 步驟

漆酶酶活測(cè)定以DMP為底物,每3ml反應(yīng)體系含:2.4ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3.5),0.5ml DMP,60 ℃保溫5 min,加入0.1ml(稀釋適當(dāng)倍數(shù)的)酶液,同時(shí)按下秒表計(jì)時(shí),在470 nm處用可見(jiàn)分光光度計(jì)在0s時(shí)記錄一次吸光度值,記為X0,間隔60s再記錄一次吸光值,記為X60。

固體酶制劑測(cè)酶活預(yù)處理:稱取0.1g固體粉末,加1ml去離子水溶解,待充分溶解后8000rpm離心5min,取上清按上述方法測(cè)其酶活。測(cè)得酶活單位為U/ml,換算成固體酶制劑的酶活還需乘以系數(shù)10,酶活單位為U/g。

A.5 計(jì)算結(jié)果

E= ×n×7.258     …………………………………(A.1)

式中:

E:酶活力,U/ml

X60:60s時(shí)記錄的吸光度值

X0:0s時(shí)記錄的吸光度值

n:稀釋倍數(shù)

A.6 精密度

    在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)值不應(yīng)超過(guò)平均值的3%。

此方法僅作為參考,具體環(huán)境不同,相應(yīng)的也會(huì)有所不同!

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